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染色體掃描電鏡標本制備及觀察
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一、原理
掃描電鏡用于觀察標本的表面形態。用戊二醛和鋨酸處理的染色體標本,經單寧酸(或硫卡巴肼)還原可獲得較好的導電染色效果。在掃描電鏡下可觀察到染色體的三維結構,也可用于常規染色體核型、G帶染色體核型、高分辨染色體核型的分析及染色體結構異常識別,以彌補光鏡的許多不足。在掃描電鏡下還可清楚地觀察到腫瘤細胞癌基因擴增結構—雙微體。因而此方法廣泛用于細胞生物學和遺傳學的許多研究。
二、染色體標本制備的方法
1.常規染色體標本制備,同實驗十。
2.取一張在光鏡下觀察過的染色體標本片選擇分散良好的分裂相,并在背面做出標記以便電鏡觀察時易于尋找。
3.3:1甲醇一冰乙酸脫色,用磷酸緩沖液洗。
4.2.5%戊二醛固定30分鐘。
5.0.1mol/L(pH7.4)PBS漂洗3次。
6.1%鋨酸固定5分鐘。
7.蒸餾水洗3次。
8.2%單寧酸處理5分鐘。
9.蒸餾水洗3次。
10.1%鋨酸處理lO分鐘。
11.水洗3次。
12.30%→100%乙醇逐級脫水,每級5分鐘。
13.臨界點干燥(也可用空氣干燥)。
14.把標本片標記的核型所在處用玻璃切下約5×5mm2 ,用導電膠固定在標本臺上。
15.離子鍍膜(也可不鍍膜直接觀察)。
16.掃描電鏡觀察、照相。
三、染色體形態觀察
低倍觀察可見染色體的不同分裂相,在分散較好的分裂相中,染色體呈三維立體形態。
高倍觀察染色體呈長短不等的園柱狀,兩條單體由著絲粒相連,其表面凹凸不平,沿縱軸有許多環形溝把染色體分成許多節段。可見染色體表面由許多細纖維構成。
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